Diplôme christel gentil

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION Christel GENTIL

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
TITRE : Toxicité des médicaments anti-VIH sur le tissu adipeux à
l’origine des causes du syndrome mixte de lipodystrophie

Soutenu le devant le jury suivant :
Dr Lacour Bernard - Président
Dr Demignot Sylvie - Rapporteur
Dr Feve Bruno - Examinateur
Dr Carrière Véronique – Examinateur
Dr Piétri-Rouxel France – Tuteur Scientifique

Laboratoire de Pharmacologie Cellulaire et Moléculaire de l'EPHE Inserm U505
Centre de recherches biomédicales des cordeliers 15 rue de l'école de médecine 75006 Paris

Laboratoire de : Institut Cochin Inserm U567, CNRS UMR8104, Université Paris 5

ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES
SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE
TOXICITE DES DROGUES ANTI-VIH SUR LE TISSU ADIPEUX A L’ORIGINE DES
CAUSES DU SYNDROME MIXTE DE LIPODYSTROPHIE
La trithérapie est le protocole le plus souvent utilisé dans la thérapie anti-VIH (Virus de l’Immunodéficience Humaine). Ce traitement est composé généralement d’un Inhibiteur de Protéase(Ip) et de deux inhibiteurs de la Reverse Transcriptase Nucleosidique (NRTI) ou Non Nucleosidique(NNRTI). Toutefois, un effet secondaire lié à la trithérapie, appelé syndrome de lipodystrophie,apparaît chez une large majorité des patients traités.
Afin d’étudier les effets opposés du traitement (lipoatrophie et lipohypertrophie) en fonction du tissu adipeux touché, nous nous sommes intéressés au contexte métabolique des dépôts adipeux et
plus particulièrement à la pression partielle d’oxygène (pO2).
Nos études in vitro ont été réalisées sur des cultures primaires d’adipocytes humains. Nous
observons que les conditions de faible pO2 (hypoxie) inhibent l’accumulation des triglycérides au
cours de la différenciation adipocytaire et modulent l’expression de facteurs adipocytaires. De plus,
nous montrons que la leptine est principalement exprimée dans les préadipocytes exprimant le
marqueur d’hypoxie HIF1-a (Hypoxia Inductible factor 1). Ces résultats suggèrent que les variations
de pO2 peuvent agir sur le métabolisme lipidique. Nous nous sommes donc intéressés à la toxicité des
NRTI en prenant en considération les différences de pO2. Nos résultats montrent, pour la première
fois, des effets différentiels des NRTI en fonction de la pO2. En effet, ils induisent une forte
déplétion de l’ADNmt uniquement en normoxie mais n’ont pas d’effet en hypoxie. De plus, ils lèvent
l’inhibition de l’accumulation des triglycérides induite par l’hypoxie.
Si l’on considère que la pO2 varie en fonction de la localisation anatomique, alors l’impact
des traitements par les NRTI ne sera pas le même en fonction des dépôts adipeux touchés. Pour
valider cette hypothèse dans un contexte plus physiologique, nous avons étudié l’expression
d’ANGPTL4, adipokine montrée comme induite par l’hypoxie, sur des coupes de tissus adipeux issus
de différentes localisations. Nos études montrent des différences d’expression d’ANGPTL4 entre les
tissus, ce qui suggère que ces tissus ne se trouvaient pas dans le même état métabolique in vivo et
pourraient répondre par conséquent différemment au traitement par les NRTI.
Mots clés : Trithérapies anti-VIH, tissu adipeux, lipodystrophie, pression partielle d’oxygène
Table des matières
1.Introduction 5

1.1 Le Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise 5 1.1.1 Apparition et évolution de la maladie 5 1.1.2 Virus de l’Immunodéficience Humaine 5 · Structure du VIH 6· Cycle de multiplication viral 6 1.2 Les thérapies anti-VIH 6 1.2.1 Les cocktails antiviraux 6 · Les inhibiteurs de la Réverse Transcriptase virale 6· Les inhibiteurs de la Protéase virale 7 1.2.2 Toxicités des cocktails antiviraux 7 1.3 Le syndrome de lipodystrophie 8 1.3.1 La lipodystrophie : une redistribution anormale du tissu adipeux 8 1.3.2 La lipodystrophie : des troubles du métabolisme 9 1.4 Physiologie du tissu adipeux 9 1.4.1 Description 9 · Le tissu adipeux brun 9· Le tissu adipeux blanc 10 1.4.2 Processus de différenciation adipocytaire 10 1.4.3 Métabolisme lipidique 12 · Apport des triglycérides et des acides gras par l’alimentation 12· La lipogénèse de novo dans l’adipocyte 12· Hydrolyse des triglycérides dans l’adipocyte 13 1.4.4 Le tissu adipeux : un organe endocrine 13 · Les adipokines 13· Autres cytokines et hormones 14 1.4.5 Différences métaboliques entre les tissus adipeux issus de 15 localisations différentes 1.4.6 Influence de l’angiogénèse induite par l’hypoxie sur l’adipogénèse 16 1.4.7 Influence de l’oxygène sur le fonctionnement mitochondrial 17 · Les mitochondries 17· La phosphorylation oxydative 18· Production de ROS 18 Abréviations
ADD1 Adipocyte Determination and Differenciation factor 1ADNc ADN complémentaireANGPTL4 Angiopoïétine Like 4AEC Amino ethylcarbazoleADN Acide DésoxyribonucléiqueARN Acide RibonucléiqueATP Adenosine Tri Phosphate AZT AzidothymidineBSA Albumine Bovine SerumC/EBPa CCAAT/Enhancer Binding ProteinaCREB cAMP Response Element Binding proteinCREM cAMP Response Element ModulatorddC 2’3’ didésoxynucléosideDFO Déféroxamine mésylateDHODH Dihydroorotate déshydrogénase FIZZ                                             Found in Inflammatory Zone Gp Glycoprotéine HIF Hypoxia Inductible Factor-1IBMX 3-Isobutyl-1-Méthylxanthine Il InterleukineIP Inhibiteur de ProtéaseKID Kinase Inductible DomainMCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein 1NNRTI Non Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors NRTI Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors PAF ParaformaldéhydePBS Phosphate Buffered SalinePCR Polymerase Chain ReactionPAI-1 Plasminogen-Activator Inhibitor-1PKA Protéine Kinase ApO2 Pression partielle en OxygènePPARg                                                                    Peroxisomes Proliferator Activated RT Reverse TranscriptaseSIDA Syndrome de l’Immunodéficience AcquiseSREBP-1 Sterol Regulatory Element Binding Protein-1SVF Sérum de Veau FœtalTNFa                                         Tumor Necrosis factor-aUCP-1 Uncoupling protein-1VEGF Vascular Endothelial Growth FactorVIH Virus de l’Immunodéficience Humaine 1. Introduction
1.1 Le Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA) 1.1.1 Apparition et évolution de la maladieC'est le 5 juin 1981 que le bulletin des centres de contrôle et de prévention des maladies des Etats-Unis a signalé les cinq premières personnes atteintes d'une forme de maladie rare, connue aujourd'hui sous le sigle SIDA (Syndrome d'immunodéficience Acquise) et dont le système immunitaire était complètement détruit. Par la suite, les découvertes se sont succédées. En 1983, les chercheurs identifiaient le virus responsable du syndrome et dès 1985, le premier test de dépistage sérologique était commercialisé. Les premiers essais cliniques avec l'AZT (Zidovudine), inhibiteur de la réverse transcriptase virale, ont débuté en 1986 mais le découragement fut total lorsque les chercheurs se sont aperçus que le virus mutait et échappait donc au traitement. Il fallut attendre 1996 avec l'arrivée des inhibiteurs de la protéase virale pour redonner un peu d'espoir aux malades. En effet, la combinaison des inhibiteurs de la réverse transcriptase virale associés aux inhibiteurs de la protéase virale entraîna une baisse de la mortalité de plus de 80%. Cependant, vingt ans après, la maladie perdure, vingt millions de personnes sont décédées à travers le monde et quarante millions 1.1.2 Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH) L'agent responsable du SIDA est le Virus de l'Immunodéficience Humaine (VIH). C'est un rétrovirus appartenant à la sous-famille des lentivirus. Les isolats peuvent être divisés en deux types, VIH-1 et VIH-2 selon leurs propriétés sérologiques et leurs séquences génomiques.
La capside virale est à symétrie icosaédrique, de 110 à 120 nm de diamètre comprenant deux copies identiques d'ARN simple brin positif, de 9,2 kb. L’enveloppe du virus est constituée d’une bicouche lipidique d’origine cellulaire hérissée de spicules glycoprotéiques, la gp41 et la gp120.
Les principales cibles du VIH sont les lymphocytes exprimant le récepteur CD4 à leur surface. Le cycle viral débute par la liaison spécifique de la glycoprotéine d’enveloppe virale, la gp120, au récepteur CD4 présent sur la cellule cible. Le changement de conformation de la gp120 induit le changement conformationel d'une autre protéine virale, la gp41, qui permet l'introduction du contenu de la capside dans le cytoplasme de la cellule. L’ARN viral peut alors être rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) grâce à la réverse transcriptase virale. L’ADNc est ensuite intégré au génome cellulaire grâce à l’intégrase virale. Il est transcrit puis traduit en polyprotéines qui seront clivées par la protéase virale. Le matériel viral est encapsidé puis bourgeonne à la membrane cellulaire. La protéase virale agit à nouveau en permettant la maturation des virions qui seront libérés Au vu de la grande variabilité du virus VIH ainsi que de son tropisme pour les cellules du système immunitaire, les chercheurs se sont orientés vers une stratégie thérapeutique visant le cycle de multiplication du virus. Dès 1986, les premiers inhibiteurs de la réverse transcriptase étaient testés.
Les inhibiteurs de la protéase virale quant à eux, ne virent le jour que 10 ans après. L’utilisation de l’association de ces deux classes de médicament a entraîné une nette augmentation de l'efficacité du · Les inhibiteurs de la Réverse Transcriptase virale Les inhibiteurs de la réverse transcriptase virale sont des analogues nucléosidiques (Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors ou NRTI) ou non nucléosidiques (NNRTI). Les analogues nucléosidiques agissent par inhibition compétitive avec les nucléosides endogènes au niveau du site de fixation de la transcriptase inverse, s’opposant à la synthèse d’ADNc viral. Les analogues non nucléosidiques agissent en se fixant au niveau d’un site très proche du site catalytique de la transcriptase inverse. Ce sont des inhibiteurs non compétitifs.
· Les inhibiteurs de la Protéase virale Les inhibiteurs de la protéase virale (IPs) agissent en se fixant sur le site actif de l’enzyme et bloquent la phase tardive de maturation virale intracellulaire. L’absence de protéase fonctionnelle aboutit à des particules virales non infectieuses.
Les premiers traitements étaient composés des NRTI et/ou des NNRTI seuls. Mais l'étude des propriétés de la réverse transcriptase a permis de montrer qu'elle ne possédait pas de mécanisme de correction. Il émergeait ainsi des virus mutants à la fin de chaque cycle de multiplication permettant une dérive progressive de la population virale et l'émergence de particules virales résistantes aux antirétroviraux. Les IPs sont venus renforcer l’efficacité du traitement et ont permis de limiter ce La trithérapie à base d'un ou deux NRTI ou NNRTI associés à un IP constitue actuellement le traitement anti-rétroviral de base largement utilisé à travers le monde développé.
Mais malgré une capacité réelle à améliorer l’état de santé des malades, à rétablir une fonction immunitaire satisfaisante avec des taux de CD4 subnormaux et à contrôler la réplication virale avec des charges virales qui peuvent devenir indétectables, les trithérapies ne guérissent pas de l’infection par le VIH. En effet, il existe des réservoirs viraux dans lesquels le virus est en état de latence et est ainsi à l'abri des traitements. De plus, les antiviraux présentent tous une certaine toxicité pour l’organisme et sont responsables d’importants effets secondaires.
1.2.2 Toxicités des cocktails antiviraux Les effets secondaires sont variés, bénins ou graves et diffèrent selon le moment de leur apparition et le type ou la classe de molécules utilisées. Les effets secondaires transitoires comme les nausées, les troubles digestifs, les vertiges, la sécheresse cutanée ou autres désagréments disparaissent en général rapidement. A moyen terme, il a été observé une toxicité mitochondriale induite par les NRTI (Martin, Hammond et al. 2003). Les NRTI sont conçus pour inhiber la réverse transcriptase virale du VIH, mais ils inhibent également une enzyme humaine, appelée mitochondriale, qui est nécessaire à la réplication de l’ADN mitochondrial (ADNmt). Une erreur du nombre de copies de l’ADNmt peut être provoquée par une exposition prolongée des patients VIH à ces agents antiviraux, il se produit alors une déplétion de l’ADNmt. Enfin, les effets à long terme le plus souvent permanents, se présentent sous la forme de troubles du métabolisme des lipides avec modification de la répartition des graisses nommé syndrome de lipodystrophie.
Dans le travail présenté dans ce rapport, nous nous intéresserons particulièrement au Il s’agit là d’un problème de santé publique, environ 50% des patients traités par les trithérapies sont touchés par ce syndrome dont les effets sont irréversibles. La vie sociale des patients s’en trouve perturbée et leur santé menacée. Ce syndrome a été dans un premier temps, associé à la prise des IPs mais aujourd’hui des patients sous NRTI seuls développent aussi une lipodystrophie.
1.3.1 La lipodystrophie: une redistribution anormale du tissu adipeux La lipodystrophie se caractérise par une redistribution anormale du tissu adipeux.
Il peut s’agir d’une lipoatrophie se caractérisant par une fonte adipeuse au niveau des membres induisant une visualisation anormale des veines et des muscles. On retrouve aussi une atrophie des boules de Bichat donnant au visage un aspect émacié. La persistance de la masse musculaire avec une force conservée est caractéristique, et permet de distinguer cette disparition du tissu adipeux de celle A cette disparition du tissu adipeux, peut être associée une lipohypertrophie située dans d’autres zones anatomiques. On assiste alors à une augmentation du tissu adipeux intrapéritonéal, Enfin, les deux phénotypes peuvent être associés chez un même patient. Il s’agit alors de la forme mixte de lipodystrophie. Malheureusement, on ne peut déterminer la chronologie d’apparition des hypertrophies et hypotrophies. Le processus d’atrophie paraît seulement dominant et durable avec 1.3.2 La lipodystrophie: des troubles du métabolisme Sont associés à cette redistribution du tissu adipeux, de nombreux désordres métaboliques : * Métabolisme glucidique: Les troubles de la glycorégulation sont particulièrement fréquents.
On décrit des cas de diabètes de type II non-insulino dépendant sous inhibiteurs de la protéase virale chez au moins 5% des patients, un état d’insulinorésistance chez 30% des patients ou une intolérance aux hydrates de carbone (Louvain Med. 121 :200-204, 2002).
* Métabolisme lipidique: On retrouve chez 30 à 40% des patients, une hypertriglycéridémie due à une augmentation de la synthèse des triglycérides, à une diminution de leur clairance et à une diminution de l’activité de la lipoprotéine lipase (Louvain Med. 121 :200-204, 2002).
Même s’il est encore difficile d’identifier précisément les cibles des molécules anti-virales, on peut néanmoins affirmer que le tissu adipeux est impliqué directement dans l’établissement du syndrome de la lipodystrophie. Son étude dans un contexte physiopathologique est primordiale afin 1.4 Physiologie du tissu adipeux 1.4.1 Description Le tissu adipeux qui apparaît faiblement au cours du deuxième trimestre de la grossesse puis plus fortement au cours du dernier trimestre (Poissonnet, Burdi et al. 1983) se développe essentiellement après la naissance. Il est principalement un tissu de stockage des triglycérides et est impliqué dans l’homéostasie lipidique. Ce tissu représente environ 20% de la masse corporelle totale d'une personne mince et son développement constitue un processus physiologique nécessaire. Il est constitué majoritairement de deux types de tissus.
Surtout abondant chez les mammifères hibernants, le tissu adipeux brun est néanmoins présent dans l’espèce humaine, principalement au début de la vie. Chez le fœtus et le nouveau-né, il se répartit dans la région interscapulaire, autour des gros vaisseaux, autour des reins et du cœur. Le tissu adipeux brun possède une fonction de thermogénèse dépendant de l’expression dans la mitochondrie de UCP-1 (uncoupling protein-1). UCP-1 a pour fonction de découpler la chaîne respiratoire de la synthèse d’ATP par dissipation du gradient de protons sous forme de chaleur. (Matthias, Jacobsson et al. 1999); (Boss, Muzzin et al. 1998). Sa localisation au contact immédiat des principaux vaisseaux sanguins facilite la diffusion dans tout l’organisme de la chaleur qu’il produit. Les adipocytes bruns ont un noyau central et un cytoplasme rempli de petites vacuoles lipidiques et de nombreuses Le tissu adipeux blanc constitue la majorité de la masse adipeuse chez l’homme adulte. C’est un tissu dynamique en perpétuel remaniement et biologiquement très actif, participant à la régulation de l’homéostasie énergétique. Les adipocytes du tissu adipeux blanc sont des cellules sphériques, d’un diamètre d’une centaine de micromètres en moyenne. Leur cytoplasme renferme une volumineuse vacuole lipidique, entourée par une mince couronne cytoplasmique contenant un appareil de Golgi, du réticulum endoplasmique granulaire, du réticulum endoplasmique lisse et des mitochondries.
1.4.2 Processus de différenciation adipocytaire Les précurseurs des adipocytes (adipoblastes) sont des cellules mésenchymateuses qui sont des précurseurs communs aux chondroblastes, ostéoblastes et myoblastes. La première d'engagement mène l'adipoblaste au préadipocyte capable de proliférer. Les préadipocytes se différencient selon un processus séquentiel en adipocytes. Les principaux facteurs de transcription impliqués dans de ce processus sont les membres de la famille CREB (cAMP Response Element Binding protein), les CCAAT/Enhancer binding Proteina (C/EBPa), le Peroxisome Proliferator Activated Receptorg (PPARg) et le Sterol Regulatory Element Binding Protein-1 (SREBP-1) (Feve * La famille des facteurs CREB (cAMP Response Element Binding protein) comprend un
large groupe de protéines qui peuvent être regroupées en trois sous-familles. Les facteurs ATF (Activating Transcription Factors), CREB et CREM (cAMP Response Elément Modulator). La structure primaire des membres de la famille CREB révèle un domaine kinase inductible (KID), qui contient un site de phosphorylation PKA. La phosphorylation de ces facteurs régule leur activité et module l'expression de gènes cellulaires en réponse aux facteurs de croissance (Reusch, Colton et al.
* Les C/EBPs (CCAAT/ Enhancer Binding Proteina) sont des facteurs de transcription qui
appartiennent à la famille des leucine-zipper de type basique. Six isoformes ont été décrits, formés à partir d'un domaine bZIP hautement conservé. C/EBP beta et delta interviennent précocement dans la mise en place de la différentiation avec SREBP alors que CEBP alpha joue un rôle dans les stades plus tardifs en maintenant l’expression de PPARg (Darlington, Ross et al. 1998); (Ramji and Foka * Les SREBPs (Facteurs Sterol Regulatory Element Binding Protein) sont des facteurs de
transcription qui appartiennent à la famille leucine-zipper double hélice de type basique. Trois membres ont été décrits mais seul SREBP1 est retrouvé dans le tissu adipeux initialement nommé ADD1 (Adipocyte determination and differenciation factor 1). SREBP1 est induit précocement au cours de la différentiation adipocytaire (Eberle, Hegarty et al. 2004).
* PPARg (Peroxisome Proliferator Activated Receptorg) est un facteur de transcription qui
appartient à la superfamille des récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes, de la vitamine D et de l'acide rétinoïque. PPARg existe sous deux isoformes, PPARg1 et PPARg2, ce dernier étant la forme la plus abondante dans le tissu adipeux. Après activation par liaison avec ses ligands physiologiques, les molécules de la famille des prostaglandines, il forme un hétérodimère avec les récepteurs de l'acide rétinoïque 9-cis (RXR). Il se lie alors à la région régulatrice d'un certain nombre de gènes adipocytaires et en contrôle la transcription. PPARg joue ainsi un rôle clé dans la différenciation adipocytaire et dans le développement du tissu adipeux, (Lazar 2005), raison pour laquelle nous nous intéresserons davantage à ce facteur lors de nos analyses de la différenciation L'expression séquentielle de ces facteurs de transcription conduit à l’expression de gènes permettant l'acquisition par l'adipocyte de fonctions caractéristiques comme la capacité à synthétiser et à hydrolyser les triglycérides mais aussi à sécréter des adipokines comme la leptine et l’adiponectine (Rangwala and Lazar 2000).
1.4.3 Métabolisme lipidique Le tissu adipeux est doté d'une très grande plasticité tissulaire. Il est en effet capable de modifier sa composition cellulaire au cours de la vie d'un individu. La croissance du tissu adipeux peut s'effectuer grâce au recrutement de nouveaux adipocytes issus de précurseurs, il s'agit de l'hyperplasie, ou par l'augmentation de la quantité de triglycérides par adipocyte déjà existant, c’est Le tissu adipeux blanc renferme la quasi-totalité des triglycérides stockés dans l’organisme.
Les triglycérides peuvent soit être apportés par l’alimentation ou bien, être synthétisés de novo par Apport des triglycérides par l’alimentation En période absorptive, les triglycérides de l’alimentation sont émulsifiés par l’action des acides biliaires, puis digérés dans l’intestin par la lipase pancréatique en acides gras libres. Après internement de ces composés, l’entérocyte reforme des triglycérides et les intègre dans les chylomicrons qui sont exportés dans la circulation.
En période post-absorptive, la glycémie diminue, ce qui interrompt la sécrétion d’insuline et stimule celle du glucagon et de l’adrénaline. Tous deux activent leurs récepteurs spécifiques et augmentent la concentration cytosolique en AMPc. La lipoprotéine lipase endothéliale, particulièrement active dans les vaisseaux capillaires du tissu adipeux, hydrolyse le contenu en triglycérides des chylomicrons en acides gras libres. Ceux-ci sont transportés dans le sang dans des poches hydrophobes d’une protéine sanguine, l’albumine. Les complexes albumine–acides gras sont endocytés par le foie, les muscles et d’autres tissus où ils sont soumis selon les besoins, à une dégradation oxydative ou réestérifiés en triglycérides.
La lipogénèse de novo dans l’adipocyte Dans l’adipocyte, la fixation de l’insuline sur son récepteur membranaire spécifique stimule la transcription du gène codant pour GLUT4. Grâce à deux protéines transmembranaires qui servent de transporteurs, GLUT1 et GLUT4, le glucose pénètre dans l’adipocyte par diffusion facilitée. Le glucose est d’une part, dégradé en pyruvate par la voie de la glycolyse dans le cytoplasme et le pyruvate est carboxylé par la pyruvate carboxylase avec formation de l’oxaloacétate dans la mitochondrie. L’oxaloacétate se condense à l’acétyl-CoA pour former du citrate capable de traverser la membrane mitochondriale interne. Sous l’action d’une citrate synthase ATP-dépendante, le citrate est clivé afin d’assurer la régénération du pyruvate.
D’autre part, le glucose initie la synthèse des triglycérides qui débute par la réaction de deux acyl- CoA sur le glycérol 3-P pour donner l’acide phosphatidique. Un hydrolase permet la formation de diacylglycérol qui réagit enfin avec un acyl-CoA pour donner le triglycéride.
Hydrolyse des triglycérides dans l’adipocyte L’utilisation des triglycérides comme source d’énergie débute par une hydrolyse par les lipases qui libèrent le glycérol, et les acides gras. Le glycérol peut être réutilisé comme précurseur de la synthèse des lipides ou du glucose. Les acides gras sont ensuite activés par l’acyl-CoA synthétase puis dégradés par b-oxydation avec formation d’un NADH, d’un FADH2 et d’un acétyl-CoA. Les acétyl-CoA sont complètement oxydés en CO2 dans le cycle de Krebs.
Ces dernières années, la mise en évidence du rôle endocrine et sécrétoire du tissu adipeux en fait un acteur essentiel dans de nombreuses réponses physiologiques de l’organisme.
1.4.4 Le tissu adipeux: un organe endocrine Les adipocytes blancs sont des cellules endocrines, autocrines, paracrines de facteurs hormonaux et de cytokines (Ailhaud 2000). Ces facteurs, les adipokines, modulent l’état de différenciation, la prolifération et l’apoptose cellulaire ainsi que l’expression des enzymes intervenant -La leptine est une protéine de 16 kDa codée par le gène ob. Les adipocytes sont les plus grands producteurs de leptine et sa concentration plasmatique est directement proportionnelle à la masse adipeuse. Son rôle essentiel est le contrôle de la prise alimentaire. En effet, des souris présentant des mutations entraînant l’absence de leptine ou de son récepteur sont obèses. D’autre part, elle a été décrite comme pouvant jouer un rôle dans les réponses immunes et inflammatoires. Enfin, la leptine présente un caractère pro-angiogénique. En effet, elle a été montrée comme interagissant avec les cellules endothéliales par des récepteurs spécifiques et ainsi module la croissance cellulaire et le processus d’angiogénèse (Bouloumie, Drexler et al. 1998).
-L’adiponectine est une protéine sérique de 30 kDa qui régule le métabolisme glucidique et lipidique. Même si les adipocytes en sont la source la plus importante, sa concentration plasmatique est négativement corrélée avec l’augmentation de la masse adipeuse. Le TNF-a qui est augmenté dans le tissu adipeux de patients obèses pourrait réguler négativement la production d’adiponectine (Beltowski 2003). Par ailleurs, l’adiponectine améliore la sensibilité à l’insuline. Enfin, elle a été montrée comme impliquée dans l’angiogénèse (Shibata, Ouchi et al. 2004); (Brakenhielm, Veitonmaki et al. 2004) et comme pouvant inhiber l’inflammation (Berg and Scherer 2005).
-La résistine est une protéine de 10 kDa qui appartient à une famille appelée FIZZ (pour Found in Inflammatory Zone). En effet, les membres de cette famille sont impliqués dans la régulation de l’inflammation. La résistine a été découverte chez la souris où elle est principalement sécrétée par le tissu adipeux. Chez l’homme, elle semble être davantage produite par les macrophages.
Même si son implication chez la souris dans le métabolisme glucidique est reconnue, son rôle chez l’homme reste encore très controversé. Des études montrent qu'elle peut être inhibée par le facteur de transcription PPARg et par l'insuline (Haugen, Jorgensen et al. 2001) alors que d'autres décrivent une stimulation de la résistine par ces facteurs (Way, Gorgun et al. 2001). -La visfatine est une adipokine récemment découverte de 52 kDa, produite et sécrétée par le tissu adipeux viscéral essentiellement (Fukuhara, Matsuda et al. 2005). La visfatine peut mimer les effets de l’insuline en se fixant au récepteur de l’insuline à des sites distincts.
-L’adipsine est exprimée chez l'Homme par les adipocytes et par la lignée monocytes- macrophages, mais chez la souris uniquement par les adipocytes (Fantuzzi 2005).
Le tissu adipeux sécrète aussi une grande variété de cytokines dont les plus connues sont le TNFa et l’IL-6. Ces deux cytokines voient leur concentration plasmatique augmentée chez les patients obèses. Le TNFa  et l’IL-6 sont des médiateurs de la réponse inflammatoire et semblent être impliqués dans le phénomène de résistance à l’insuline (Fantuzzi 2005).
Le tissu adipeux sécrète de nombreuses autres cytokines comme l’IL-1 ou l’IL-10 et des chimiokines comme MCP-1 ou IL-8 (Fantuzzi 2005).
Le tissu adipeux est un organe métaboliquement très hétérogène. En effet, l'expression des facteurs de transcription et des protéines impliquées notamment dans la lipogénèse et lors de la lipolyse varie selon la localisation anatomique du tissu adipeux.
1.4.5 Différences métaboliques entre les tissus adipeux issus de localisations Comme mentionné précédemment (1.3), le syndrome de lipodystrophie se caractérise par une redistribution anormale du tissu adipeux avec une hypertrophie du tissu intrapéritonéal et une lipoatrophie du tissu sous-cutané. Le fait que ces tissus répondent différemment aux drogues suggère qu'il existe des différences d'états métaboliques entre ces tissus issus de localisations différentes.
Anatomiquement, le réseau veineux du tissu adipeux viscéral est drainé par le système porte, il peut ainsi délivrer directement au foie les acides gras sécrétés (Lafontan and Berlan 2003). Ce procédé peut être à l'origine des intolérances au glucose et à l'insuline caractéristiques des obésités viscérales.
De par sa résistance à l'insuline, hormone régulant négativement la lipolyse, et de sa grande sensibilité aux catécholamines, molécules induisant la lipolyse, le tissu adipeux intrapéritonéal présente une activité lipolytique nettement supérieure à celle du tissu adipeux sous-cutané (Lafontan Par ailleurs, nous savons que l'obésité est fortement corrélée à l'augmentation du niveau de leptine circulante. Les équipes de Montague (Montague, Prins et al. 1997) et de Van Harmelen (Van Harmelen, Reynisdottir et al. 1998) ont alors recherché si sa sécrétion variait selon les localisations du tissu adipeux. Ces recherches ont mis en évidence un niveau d'expression de la leptine dans le tissu sous-cutané supérieur à celui mesuré dans le tissu viscéral. Cela s'explique en partie par la présence d'adipocytes de grande taille et plus riches en triglycérides que ceux qui constituent le tissu sous- cutané (Tchernof, Belanger et al. 2006). Une autre étude a montré une expression de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), de l'Il6 ou du PAI-1 (Plasminogen-Activator Inhibitor-1) plus importante dans le tissu adipeux viscéral comparé au tissu adipeux sous-cutané (Fain, Madan et al. 2004).
L'ensemble de ces travaux décrit des tissus adipeux issus de localisations différentes qui sont 1.4.6 Influence de l'angiogénèse induite par l'hypoxie sur l'adipogénèse Le tissu adipeux, d'une grande plasticité cellulaire, a la capacité de poursuivre sa croissance et son développement tout au long de la vie adulte. L'angiogénèse permettant la néovascularisation et l’oxygénation est fortement sollicitée. L'hétérogénéité métabolique existant entre les différents tissus adipeux peut aussi être due à des variations dans le processus d'angiogénèse.
L'angiogénèse est un processus de néoformation de vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Il existe en effet, des rapports étroits entre le développement du tissu adipeux et celui du système vasculaire. Les équipes de Sierra-Honigmann (Sierra-Honigmann, Nath et al. 1998) et de A.
Bouloumié (Bouloumie, Drexler et al. 1998) ont étudié le caractère angiogénique de la leptine dans les cellules endothéliales. Ils ont montré que l’activation de la leptine augmentait la survie et la prolifération des cellules. Cela suggère que l'endothélium vasculaire est une cible de la leptine et qu'elle possède un rôle angiogénique. Des facteurs angiogéniques comme le VEGF ont été montré comme impliqués lors du développement du tissu adipeux (Voros, Maquoi et al. 2005). Or nous avons pu voir précédemment que la leptine et le VEGF étaient sécrétés différemment selon la localisation du tissu adipeux. Ces différents types de tissus pourraient donc être soumis à des différences de L'angiogénèse dépend étroitement de la pression partielle d’oxygène au niveau tissulaire et cellulaire. L'angiogénèse induite par l'hypoxie pourrait impliquer les facteurs de transcription de la famille HIF (Hypoxia Induced Factor) dont HIF-1a. En normoxie, deux résidus prolines dans le domaine ODD (oxygen-dependent degradation domain) de HIF-1a sont hydroxylées par des prolyl hydroxylases (Lee, Bae et al. 2004). L’hydroxylation démasque un site de liaison pour une protéine oncogène, Von Hippel Lindau (VHL), et cible la protéine vers le protéasome où elle est dégradée. En hypoxie, il n’y a pas d’hydroxylation, HIF-1a n’est plus dégradé et s’accumule sous une forme active. Il migre ensuite dans le noyau et reconnait les éléments de réponse à l’hypoxie (Schurmann, Bergmann et al.) dans les régions régulatrices des gènes cibles comme la leptine ou PPARg.
Une étude a montré que la stabilisation de HIF-1a  dans des adipocytes en condition hypoxique est associée à l’augmentation de l’expression de facteurs proangiogéniques comme VEGF (Lolmede, Durand de Saint Front et al. 2003). La leptine ou PPARg ont été décrits comme pouvant être régulés par HIF-1a. En effet, une étude a montré que l'hypoxie stimulait l’expression de la leptine grâce à l’interaction de HIF-1a avec un site consensus HRE localisé dans son promoteur.
(Grosfeld, Andre et al. 2002). HIF-1a a aussi été impliqué dans l'inhibition de l'adipogénèse par l'hypoxie dans des lignées de rongeurs en interagissant avec PPARg (Yun, Maecker et al. 2002). Une autre protéine, une angiopoïétine, ANGPTL4, permet d’établir un lien entre l’angiogénèse et l’adipogénèse. En effet, il s’agit d’une adipokine sécrétée par le tissu adipeux et un facteur angiogénique dont l’expression est induite par l’hypoxie (Yoon, Chickering et al. 2000). Elle a été découverte par différents groupes: Kim et al (Kim, Kawada et al. 2003) l'ont identifiée comme une angiopoiétine du fibrinogène hépatique nommée HFARP. Les équipes de Kersten (Kersten, Mandard et al. 2000) et de Yoon (Yoon, Chickering et al. 2000) ont montré quant à eux que ANGPTL4 était un gène cible de PPARa dans le foie et PPARg dans le tissu adipeux. L'équipe de Stéphane Germain, (Le Jan, Amy et al. 2003) a mis en évidence l'induction d'ANGPTL4 par l'hypoxie dans des cellules endothéliales en culture et qu'elle était exprimée dans des conditions d'angiogénèse réactionnelle.
L'ensemble de ces études suggèrent qu'ils existent des liens étroits entre l'adipogénèse, 1.4.7 Influence de l’oxygène sur le fonctionnement mitochondrial L’implication de la mitochondrie dans la plasticité du tissu adipeux ainsi que son rôle dans le métabolisme du tissu adipeux est fondamental.
Spécifiques de la cellule eucaryote, les mitochondries sont des organites à forme variable.
Sphériques dans les adipocytes, elles sont limitées par une membrane externe et une membrane interne très repliée. L’importance des invaginations de la membrane interne, appelées crêtes mitochondriales, est fonction de l’intensité de la respiration. La matrice mitochondriale contient de nombreuses enzymes comme celles de la b-oxydation des acides gras, des nucléotides, des substrats ou des ions. On y trouve aussi le matériel génétique propre à la mitochondrie, son ADN circulaire, les différents ARN et ribosomes servant à la synthèse de certaines protéines mitochondriales. Alors que la membrane externe laisse diffuser librement des composés jusqu’à 10 kDa, la membrane interne ne permet que des transferts sélectifs, grâce à des systèmes de transporteurs.
La membrane interne est pourvue de quatre complexes macromoléculaires permettant les transferts successifs des électrons vers l’accepteur final, l’O2. C’est le phénomène de respiration cellulaire. Les réactions d’oxydoréduction génèrent l’énergie nécessaire au transfert de protons dans l’espace intermembranaire de la mitochondrie. Ce processus génère un gradient électrochimique transmembranaire de concentrations en protons dont la dissipation est couplée à la formation d’ATP.
Cette réaction résulte de la catalyse de l’ATP synthase. La phosphorylation oxydative est donc le couplage entre la respiration cellulaire et la formation d’ATP.
En plus de son rôle de production d’ATP, la mitochondrie constitue la première productrice d’espèces actives de l’oxygène (ROS) dans de nombreux types cellulaires. Lors de la respiration, une petite mais significative proportion de molécules d’O2 sont converties en radical d’anions superoxyde 2 ) par les complex I et III. Ce radical est transformé en péroxyde d’hydrogène (H2O2) et en radical hydroxyl (.OH) (Carriere, Carmona et al. 2004). La production de ROS en faible quantité est
physiologique et n’a pas d’incidence sur le métabolisme énergétique. En revanche, des travaux ont montré qu’en hypoxie, la mitochondrie augmentait sa production de ROS. Ces signaux oxydants agiraient comme des seconds messagers en réponse à l’hypoxie (Chandel and Schumacker 2000).
Notre hypothèse de travail est basée sur le fait que si les paramètres environnementaux comme la pression partielle d’oxygène (pO2) varient en fonction des dépôts adipeux, sous cutanés ou viscéraux, alors l’angiogénèse, le métabolisme lipidique et le nombre de mitochondries seraient différents entre ces tissus. Les conséquences d’un traitement antiviral, altérant notamment les mitochondries et l’adipogénèse, seraient alors différentes selon les tissus adipeux touchés.
Il paraît important dans ce contexte, d’évaluer la toxicité des NRTI sur des cultures
primaires d’adipocytes humains en considérant les effets sur l’accumulation des triglycérides et
sur la toxicité mitochondriale, le tout prenant en considération les stimuli environnementaux
comme la pO2.
· L'hypoxie a-t-elle une influence sur l'adipogénèse et par quels mécanismes ?· Quels sont les effets des NRTI sur l’accumulation des triglycérides et sur la quantité d'ADN · Les effets des NRTI varient-ils selon la pO2 ?· Existe-t-il des variations de pO2 entre les différents tissus adipeux issus de localisations différentes qui expliqueraient les effets duels des NRTI en fonction de la localisation ? Bibliographie

Ailhaud, G. (2000). "Adipose tissue as an endocrine organ." Int J Obes Relat Metab Disord 24(Suppl
An, W. G., M. Kanekal, et al. (1998). "Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducible factor 1alpha." Nature 392(6674): 405-8.
Beltowski, J. (2003). "Adiponectin and resistin--new hormones of white adipose tissue." Med Sci Monit 9(2): RA55-61.
Berg, A. H. and P. E. Scherer (2005). "Adipose tissue, inflammation, and cardiovascular disease." Circ Res 96(9): 939-49.
Blanch, J., A. Rousaud, et al. (2002). "Impact of lipodystrophy on the quality of life of HIV-1- infected patients." J Acquir Immune Defic Syndr 31(4): 404-7.
Boss, O., P. Muzzin, et al. (1998). "The uncoupling proteins, a review." Eur J Endocrinol 139(1): 1-9.
Bouloumie, A., H. C. Drexler, et al. (1998). "Leptin, the product of Ob gene, promotes angiogenesis."
Circ Res 83(10): 1059-66.
Brakenhielm, E., N. Veitonmaki, et al. (2004). "Adiponectin-induced antiangiogenesis and antitumor activity involve caspase-mediated endothelial cell apoptosis." Proc Natl Acad Sci U S A 101(8): 2476-81.
Carr, A., K. Samaras, et al. (1998). "A syndrome of peripheral lipodystrophy, hyperlipidaemia and insulin resistance in patients receiving HIV protease inhibitors." Aids 12(7): F51-8.
Carriere, A., M. C. Carmona, et al. (2004). "Mitochondrial reactive oxygen species control the transcription factor CHOP-10/GADD153 and adipocyte differentiation: a mechanism for
hypoxia-dependent effect." J Biol Chem 279(39): 40462-9.
Chandel, N. S., D. S. McClintock, et al. (2000). "Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: a mechanism of O2
sensing." J Biol Chem 275(33): 25130-8.
Chandel, N. S. and P. T. Schumacker (2000). "Cellular oxygen sensing by mitochondria: old questions, new insight." J Appl Physiol 88(5): 1880-9.
Darlington, G. J., S. E. Ross, et al. (1998). "The role of C/EBP genes in adipocyte differentiation." J Biol Chem 273(46): 30057-60.
Eberle, D., B. Hegarty, et al. (2004). "SREBP transcription factors: master regulators of lipid homeostasis." Biochimie 86(11): 839-48.
Fain, J. N., A. K. Madan, et al. (2004). "Comparison of the release of adipokines by adipose tissue, adipose tissue matrix, and adipocytes from visceral and subcutaneous abdominal adipose
tissues of obese humans." Endocrinology 145(5): 2273-82.
Fantuzzi, G. (2005). "Adipose tissue, adipokines, and inflammation." J Allergy Clin Immunol 115(5):
Feve, B. (2005). "Adipogenesis: cellular and molecular aspects." Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 19(4): 483-99.
Fukuhara, A., M. Matsuda, et al. (2005). "Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin." Science 307(5708): 426-30.
Grosfeld, A., J. Andre, et al. (2002). "Hypoxia-inducible factor 1 transactivates the human leptin gene promoter." J Biol Chem 277(45): 42953-7.
Grosfeld, A., V. Zilberfarb, et al. (2002). "Hypoxia increases leptin expression in human PAZ6 adipose cells." Diabetologia 45(4): 527-30.
Hagen, T., C. T. Taylor, et al. (2003). "Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha." Science 302(5652): 1975-8.
Haugen, F., A. Jorgensen, et al. (2001). "Inhibition by insulin of resistin gene expression in 3T3-L1 adipocytes." FEBS Lett 507(1): 105-8.
Hazan, U., I. A. Romero, et al. (2002). "Human adipose cells express CD4, CXCR4, and CCR5 [corrected] receptors: a new target cell type for the immunodeficiency virus-1?" Faseb J
16(10): 1254-6.
Kersten, S., S. Mandard, et al. (2000). "Characterization of the fasting-induced adipose factor FIAF, a novel peroxisome proliferator-activated receptor target gene." J Biol Chem 275(37): 28488-
93.
Kim, C. S., T. Kawada, et al. (2003). "Macrophage inflammatory protein-related protein-2, a novel CC chemokine, can regulate preadipocyte migration and adipocyte differentiation." FEBS Lett
548(1-3): 125-30.
Lafontan, M. and M. Berlan (2003). "Do regional differences in adipocyte biology provide new pathophysiological insights?" Trends Pharmacol Sci 24(6): 276-83.
Lazar, M. A. (2005). "PPAR gamma, 10 years later." Biochimie 87(1): 9-13.
Le Jan, S., C. Amy, et al. (2003). "Angiopoietin-like 4 is a proangiogenic factor produced during
ischemia and in conventional renal cell carcinoma." Am J Pathol 162(5): 1521-8.
Lee, J. W., S. H. Bae, et al. (2004). "Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions." Exp Mol Med 36(1): 1-12.
Lolmede, K., V. Durand de Saint Front, et al. (2003). "Effects of hypoxia on the expression of proangiogenic factors in differentiated 3T3-F442A adipocytes." Int J Obes Relat Metab Disord
27(10): 1187-95.
Martin, A., D. E. Smith, et al. (2004). "Reversibility of lipoatrophy in HIV-infected patients 2 years after switching from a thymidine analogue to abacavir: the MITOX Extension Study." Aids 18(7): 1029-36.
Martin, A. M., E. Hammond, et al. (2003). "Accumulation of mitochondrial DNA mutations in human immunodeficiency virus-infected patients treated with nucleoside-analogue reverse-
transcriptase inhibitors." Am J Hum Genet 72(3): 549-60.
Matthias, A., A. Jacobsson, et al. (1999). "The bioenergetics of brown fat mitochondria from UCP1- ablated mice. Ucp1 is not involved in fatty acid-induced de-energization ("uncoupling")." J
Biol Chem 274(40): 28150-60.
Montague, C. T., J. B. Prins, et al. (1997). "Depot- and sex-specific differences in human leptin mRNA expression: implications for the control of regional fat distribution." Diabetes 46(3):
342-7.
Nolan, D., E. Hammond, et al. (2003). "Mitochondrial DNA depletion and morphologic changes in adipocytes associated with nucleoside reverse transcriptase inhibitor therapy." Aids 17(9):
1329-38.
Petit, C., F. Pietri-Rouxel, et al. (2005). "Oxygen consumption by cultured human cells is impaired by a nucleoside analogue cocktail that inhibits mitochondrial DNA synthesis." Mitochondrion
5(3): 154-61.
Poissonnet, C. M., A. R. Burdi, et al. (1983). "Growth and development of human adipose tissue during early gestation." Early Hum Dev 8(1): 1-11.
Qutub, A. A. and A. S. Popel (2006). "A computational model of intracellular oxygen sensing by hypoxia-inducible factor HIF1 alpha." J Cell Sci 119(Pt 16): 3467-80.
Ramji, D. P. and P. Foka (2002). "CCAAT/enhancer-binding proteins: structure, function and regulation." Biochem J 365(Pt 3): 561-75.
Rangwala, S. M. and M. A. Lazar (2000). "Transcriptional control of adipogenesis." Annu Rev Nutr 20: 535-59.
Reusch, J. E., L. A. Colton, et al. (2000). "CREB activation induces adipogenesis in 3T3-L1 cells." Mol Cell Biol 20(3): 1008-20.
Rupnick, M. A., D. Panigrahy, et al. (2002). "Adipose tissue mass can be regulated through the vasculature." Proc Natl Acad Sci U S A 99(16): 10730-5.
Schurmann, D., F. Bergmann, et al. (1998). "Gynaecomastia in a male patient during protease inhibitor treatment for acute HIV disease." Aids 12(16): 2232-3.
Setzer, B., M. Schlesier, et al. (2005). "Mitochondrial toxicity of nucleoside analogues in primary human lymphocytes." Antivir Ther 10(2): 327-34.
Shibata, R., N. Ouchi, et al. (2004). "Adiponectin stimulates angiogenesis in response to tissue ischemia through stimulation of amp-activated protein kinase signaling." J Biol Chem
279(27): 28670-4.
Sierra-Honigmann, M. R., A. K. Nath, et al. (1998). "Biological action of leptin as an angiogenic factor." Science 281(5383): 1683-6.
Tchernof, A., C. Belanger, et al. (2006). "Regional differences in adipose tissue metabolism in women: minor effect of obesity and body fat distribution." Diabetes 55(5): 1353-60.
Van Harmelen, V., S. Reynisdottir, et al. (1998). "Leptin secretion from subcutaneous and visceral adipose tissue in women." Diabetes 47(6): 913-7.
Van Harmelen, V., K. Rohrig, et al. (2004). "Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot
of obese subjects." Metabolism 53(5): 632-7.
van Wijk, J. P., E. J. de Koning, et al. (2005). "Comparison of rosiglitazone and metformin for treating HIV lipodystrophy: a randomized trial." Ann Intern Med 143(5): 337-46.
Voros, G., E. Maquoi, et al. (2005). "Modulation of angiogenesis during adipose tissue development in murine models of obesity." Endocrinology 146(10): 4545-54.
Walker, U. A., M. Auclair, et al. (2006). "Uridine abrogates the adverse effects of antiretroviral pyrimidine analogues on adipose cell functions." Antivir Ther 11(1): 25-34.
Way, J. M., C. Z. Gorgun, et al. (2001). "Adipose tissue resistin expression is severely suppressed in obesity and stimulated by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists." J Biol
Chem 276(28): 25651-3.
Yoon, J. C., T. W. Chickering, et al. (2000). "Peroxisome proliferator-activated receptor gamma target gene encoding a novel angiopoietin-related protein associated with adipose
differentiation." Mol Cell Biol 20(14): 5343-9.
Yun, Z., H. L. Maecker, et al. (2002). "Inhibition of PPAR gamma 2 gene expression by the HIF-1- regulated gene DEC1/Stra13: a mechanism for regulation of adipogenesis by hypoxia." Dev
Cell 2(3): 331-41.

Source: http://www.ephe.sorbonne.fr/images/stories/scd_ephe/monographies_svt/biol_cell_mol/ephe_dip_gentil_pcm07.pdf